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PCR实验室防污染措施及应急处理方法!

发表时间:2019-09-20

来源:北京卓诚惠生

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污染,是PCR实验室出现实验假阳性、结果不可信、研发不可靠的重要推手,PCR实验室应当将防污染作为日常管理、实验安排、清洁消毒、实验习惯的核心。PCR 实验污染和细胞污染是有差别的,PCR 实验污染主要是核酸而不是细菌和其他入侵者。因此所有的预防措施都会稍稍有所不同。“易查不易察”,污染来的悄无声息,我们该如何应对。今天给大家简单介绍一下PCR实验室的主要污染来源、实验中如何避免和减少污染的可能性及实验发生污染的应急处理方案。

 
PCR实验室的污染来源
 
1、标本间交叉污染:
收集样本的容器被污染或标本密封不严外溢;不同样本移液时忘记更换枪尖或未使用带滤芯枪尖;移液器等实验器具及耗材未及时消毒灭菌;不同样本同时开盖或样本剧烈震荡、反复吹吸导致气溶胶形成扩散,相互交叉污染。
 
2、实验试剂污染:
主要是在 PCR 组分试剂加样过程中,由于移液器、容器、阴性对照及其它试剂被核酸模板或阳性对照污染。加样过程中,因为 PCR 试剂对温度十分敏感,需要通过冰浴使得 PCR 试剂和 PCR 板/管处于 0℃,但这个过程也是充满了污染的风险的。
 
3、扩增产物污染:
大量拷贝的产物泄漏或扩增后的PCR反应管意外开盖,这是 PCR 反应中最主要最常见的污染问题。因为 PCR 产物拷贝量大,远远高于 PCR 检测数个拷贝的极限,所以极微量的 PCR 产物污染,就可形成假阳性。
 
4、克隆质粒污染:
作为阳性质控品的克隆质粒外溢。
 
PCR实验室的防污染方法
 
按照实验室的安全工作制度或安全标准操作程序,所有操作符合《实验室生物安全通用要求》(GB19489-2008)。
 
1、严格执行各区功能划分:
 
试剂储存和准备区:贮存试剂的制备、试剂的分装和扩增反应混合液的准备,以及离心管、吸头等消耗品的贮存和准备。
 
标本制备区:核酸(RNA、DNA)提取、贮存及其加入至扩增反应管。对于涉及临床标本的操作,应符合生物安全二级实验室防护设备、个人防护和操作规范的要求。
 
扩增区:cDNA合成、DNA扩增及检测。
 
扩增产物分析区:扩增片段的进一步分析测定,如杂交、酶切电泳、变性高效液相分析、测序等。
 
试剂准备区、标本制备区和扩增区内的实验用品,包括移液器等器具应专用,空气、物品流向依次为:试剂准备区、标本制备区、扩增区、产物分析区,不可逆行。
 
2、清洁的实验用品:
实验室自配试剂(去离子水、缓冲液等)和所有使用器具在使用之前均应高压灭菌或紫外杀菌。枪尖、反应管等实验耗材应一次性使用。
 
3、正确的实验操作:
实验应在超净工作台内进行,工作台内应放置PCR专用的微量离心机、各量程的移液器和其他必须物品。
 
实验的过程中选择最合适尺寸的手套并能及时更换,在进出不同实验区域或进行模板操作后都应更换实验服、口罩、帽子及手套,以避免不同实验区交叉污染。
 
装有PCR试剂的反应管在打开之前应先瞬时离心,将管壁及管盖上的液体离至管底,降低污染手套或加样器的风险;谨慎开启反应管,防止管内液体溅出或形成气溶胶导致污染。
 
吸加试剂和模板的操作应严格按照规范要求进行,遵守“慢吸快打”原则,尽量一次性完成,忌多次抽吸,以避免气溶胶产生的交叉污染。
 
PCR试剂建议小量分装,以减少反复冻融、重复取样次数;多样本PCR反应时,先配制反应混合液分装至反应管中,最后加入样本核酸,请勿同时开盖,尽量保证单人单管,实现完全闭管操作。
 
实验试剂应与样品和PCR产物分开保存,不应放于同处。
 
PCR扩增实验完成后及时将反应管取出,用一次性手套将产物反应管包裹丢弃,保证管盖紧闭。
 
4、规范的实验设计:
应遵循实验室内部质量控制的相关规定,实验中设立阳性对照、阴性对照和空白对照,全程质控实验过程,验证PCR反应的可靠性,并协助判断扩增系统的可信性。
 
PCR实验室的污染应急处理方法
 
1、若核酸标本溢出:
立即用布或纸巾覆盖,由外围向中心倾倒10%的次氯酸消毒剂,约30分钟后,清除污染物品,再用次氯酸消毒剂擦拭,并用75%酒精喷洒,移动紫外车定点照射1小时。
 
2、其他不明情况污染:
1、暂停所有实验操作;
2、清理实验室内所有物品,寻找污染来源;
3、加大实验室的通风;
4、对实验室内所有表面(台面、地面及墙面) 进行消毒;
5、75%酒精空中喷雾;
6、开启紫外消毒装置,延长紫外照射时间(4小时以上);
7、以上措施每日进行,直至污染消除;用新试剂及确认无污染的器材进行原污染项目的试剂空白检测,连续3次均阴性后方可进行常规检测。
 
PCR污染的范围很广,不同楼层也会产生影响,甚至会影响相邻建筑;PCR污染的时间很长,几个月甚至半年;PCR污染的影响很深,影响我们的生产计划,阻碍我们的研发进度,直接造成公司人力、财力的损失。但随着新技术和一些问题的明晰,无污染PCR检测的那一天离我们会越来越近!
 
内容来源:冯忠军. 河北医科大学第三医院检验科,
黄启慧. 实时定量PCR实验室管理及污染预防[J]. 内蒙古中医药, 2012(4):62-62.
李金明. 实时荧光PCR技术[M]. 第2版. 北京: 科学出版社,2018
 
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